脂質體的表征

脂質體的表征

為了對脂質體制劑進行適當的質量控制，需要在制備和儲存后對其進行充分的表征。在分析和生物分析領域中應用的脂質體，主要特征包括平均粒徑和多分散系數、包封率和層狀度測定。其他常用的檢測參數包括通過Zeta電位測量表面電荷、通過差示掃描量熱法（DSC）測定相轉變等。這里詳細給出了參數的表征方法。

◆ 1. 脂雙層測定：

在該方法中，將磷脂膜沉積在電極上，隨后在電場作用下，水化幾個小時。盡管通過施加交流電和直流電能形成巨大的單層脂質體，但直流電場有一定的不足，由于水電解而發生起泡。電形成法制備出的脂質體80%是較完-美的單層脂質體。

◆ 2.  脂質體粒徑大小和粒徑分布：

脂質體的平均直徑及其分布是脂質體制劑的關鍵參數，尤其是當它們通過非腸道給藥途徑或吸入給藥時更為重要。

采用不同的方法可考察脂質體的平均大小和粒徑分布。這些技術包括顯微鏡觀察、靜態或動態光散射、粒徑尺寸排阻色譜（SEC）和場流分離技術。

為了得到關于脂質體在粒徑大小和分布方面的一些較好和可靠的結果，可使用包括透射電子顯微鏡（TEM）、冰凍蝕刻透射電鏡、負染色和冷凍電子顯微鏡等方法。

這些技術能夠為脂質體提供準確的結果，因為用它們可觀察脂質體形態并且可以分辨不同大小的粒子。另一方面，樣品制備比較復雜。此外，由于使用這些方法，會產生偽影，引起收縮和變形，并且獲得代表性粒徑大小分布耗時較長，因此，不適于常規測量。在樣品制備中多加注意可以解決部分問題，獲得可重復且準確的結果。

最近，原子力顯微鏡（AFM）技術已被用于研究脂質體形態、大小和穩定性。AFM，為分辨率接近0.1nm的掃描探針顯微鏡，無須處理樣品，也能在自然環境中實現對小脂質體的可視化，可得到脂質體表面的高分辨率三維輪廓。

該技術可在不改變其原始存在形式的前提下，實現脂質體可視化；必要的表面固定不會對樣品產生不利影響，而且探針本身也不會對脂質體產生不-良影響。

AFM分析是一種相對無創的技術，功能強大，速度快。它可以提供有關形態、大小及脂質體儲存期間可能發生聚集過程的信息。

◆ 3. 轉變溫度：

磷脂如兩親性分子具有在低于其熔點的溫度下經歷熱致轉變的獨特特征。

1) 烴鏈的化學性質極大地影響著轉變溫度；

2) ?；湹拈L度、烴鏈中不飽和度、分子的極性區域、烴鏈上甲基直鏈及懸浮介質的性質和離子強度對轉變溫度具有重要影響；

3) 當鏈長減小時，轉變溫度較低。同樣地，支鏈和龐大側基的存在及?；湹牟伙柡投纫步档土宿D變溫度；

4) 與反式-不飽和烴尾基相比，順式-不飽和烴尾基的轉變溫度較低；

5) 脂質體的制備和應用受磷脂膜的轉變和流動性的影響較大；

6) 脂質體囊泡的特性如聚集行為、蛋白質結合模式和融合與滲透性由磷脂的轉變溫度決定。

較低的轉變溫度對脂質體是有利的。與具有較低轉變溫度的磷脂相比，具有較高轉變溫度的脂質體釋藥更慢。因此，脂質體轉變溫度的測定對于具有所需性質的制劑是至關重要的。為了測定磷脂的轉變溫度，廣泛采用DSC方法。   

◆ 4. 表面電荷：

脂質體可以是中性的、帶正電的或帶負電的。

? 通過使用磷脂如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰膽堿獲得中性表面囊泡。

? 具有帶負電荷表面的脂質體可以用酸性磷脂如磷脂酸、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰甘油或十六烷基磷酸酯獲得。

? 磷脂如二油?；?甲基銨丙烷或硬質酰胺，用于制備帶正電荷表面的脂質體。

表面電荷是一個重要參數，因為它決定了脂質體的包封率和穩定性。當脂質體和帶電藥物之間存在靜電吸引力時，藥物包封率增加。脂質體表面的電荷密度和各種離子與脂質體的結合親和力可通過測量Zeta電位這一參數來確定。

◆ 5.  Zeta電位：

粒子的Zeta電位是粒子在特定介質中獲得的總電荷。它是混懸狀態的粒子所表現出的物理性質。人們早已認識到，Zeta電位的測量通常用于預測膠體系統的穩定性。如果混懸液中的所有粒子都具有較大的負或正Zeta電位，那么它們將傾向于相互排斥并且不會聚集。但是，如果粒子具有較低的Zeta電位值，那么斥力不足以防止粒子絮凝。
對于Zeta電位測定，使用激光來作為照射樣品內的粒子的光源。入射激光束穿過樣品池的中心，并檢測到約13°角的散射光。當向池內施加電場時，任何移動通過測量容積的粒子將產生光的波動信號，其頻率與粒子速度成比例。將該信號傳遞給數字信號處理器，然后經計算機計算，從而得到Zeta電位數值。

◆ 6. 脂雙層流動性：

脂雙層流動性研究是考察磷脂分子鏈在雙層中的動力學行為和有序性。脂質體的組成影響脂雙層的流動性，這方面研究較廣泛。

向磷脂膜中添加膽固醇能降低脂肪酸烴鏈之間的范德華相互作用，從而防止脂質體結晶，對脂雙層流動性產生重要影響。同樣地，將一些流體脂質添加到脂質體雙層中，它們會干擾屏障功能，從而增加其流動性并降低其轉變溫度。脂質體的藥物釋放行為由脂雙層的數量、流動性和滲透性決定。

關于脂雙層流動性的研究使用了多種技術手段，包括H-NMR光譜、EPR和去極化熒光。其中，EPR是確定脂雙層流動性和結構變化的一種有效方法。

◆ 7.  體外藥物釋放：

可以使用透析法進行體外藥物釋放。透析袋膜應在經過各種篩選后再選擇，不應發生藥物吸附，并且膜應該可以自由滲透活性成分（截留分子量不應該是擴散過程中的限制步驟）。將幾毫升適量的脂質體分散液置于透析袋中，密封并置入含有釋放介質的容器中。在持續磁力攪拌下將整個系統保持在37℃，封閉釋放介質以避免溶解介質蒸發。

在漏槽條件下進行動力學實驗。在不同的時期間隔取樣品，并通過高效液相色譜（HPLC）、分光光度計或任何其他簡便的方法測定藥物。用新鮮的溶出介質替換樣品同體積的釋放介質，以使受體隔室的體積保持恒定。每個動力學實驗平行進行3次，取平均值以確定藥物從脂質體中的釋放曲線。

 ◆ 8. 包封率：

根據藥物的極性和溶解度，藥物可以多種方式與脂質體相互作用。

藥物或生物活性物質可以包封在脂雙層中，插入極性頭部基團，吸附在膜表面上，通過疏水尾部錨定，或包封在內部水性核心中。需要對脂質體性質進行廣泛研究，以實現藥物的最大包封并能預期實現控制其釋放。

1、磷脂的制備和組成都影響脂質體制劑的包封率。膽固醇在藥物包封中的作用也很重要，因為將它加入磷脂膜可以提高包封率。

由于部分藥物仍保持游離狀態，并未被包封，在確定包封之前，必須從脂質體制劑中除去游離藥物。

? 通過HPLC、熒光分光光度法和UV/VIS光譜法等分析技術對脂質體包封的藥物進行定量測定，

? 還可以使用熒光染料鈣黃綠素測定脂質體的包封率。該方法通過添加鈷陽離子對未包裹的鈣黃綠素進行熒光猝滅，簡單易行，在測定前不需要去除游離染料。

2、電子自旋共振光譜法也可用于確定脂質體的包封率，加入順磁性試劑如鐵氰化物可使外部自旋標記的標記物顯著變寬。

3、還可以利用二維擴散排序核磁共振光譜法考察包封率，測量原理基于包封和游離標記物質如蔗糖之間的擴散系數差異。

4、也有學者提出一種快速簡單的實驗方法，使用1H-NMR結合pH敏感標記化合物（高聚肌氨酸）來確定脂質體的包封率，而無需物理分離游離包封標記物。

PhD納米高壓均質機、脂質體擠出器，均質和過濾擠出的壓力可調、溫度可設置，

可選用不同孔徑的過濾膜，可將各類載藥脂質體處理到100nm以內，粒徑均勻，且包封率高。